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核酸电泳新选择——全自动快速分析核酸
来源: | 作者:201321492800086 | 发布时间: 29天前 | 110 次浏览 | 分享到:
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一,用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段,而电泳的质量直接决定了后续实验的成败,实验室常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一,用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段,而电泳的质量直接决定了后续实验的成败,实验室常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法以琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶作为支持物。琼脂糖凝胶是一种聚合链线性分子含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同,适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺在在催化物催化条件下聚合形成长链,并通过亚甲双丙烯酰胺交叉连接形成网孔,网孔的大小由丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺的相对比例决定。电泳就是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。核酸分子是两性解离分子,pH3.5是碱基上的氨基解离,而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离,所以核酸分子带正电,在电场中向负极泳动;而pH8.0-9.3时,碱基几乎不解离,而磷酸基团解离,所以核酸分子带负电,在电场中向正极泳动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此净电荷对泳动速度影响不大,使得它们能以同样的速率向正极方向移动。

在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同,如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA。


琼脂糖凝胶适合分离长度100bp至20kb的分子,聚丙烯酰胺凝胶对于小片段(5bp-500bp)的分离效果最好。


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琼脂糖凝胶形成过程


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琼脂糖凝胶


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丙烯酰胺分子式


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N,N’-亚甲双丙烯酰胺


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聚丙烯酰胺网状结构


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聚丙烯酰胺凝胶


影响核酸分子泳动率的因素主要有:

1、样品的物理性状

即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言,电荷密度越大,泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同,所以对泳动率的影响不明显。

对线形分子来说,分子量的常用对数与泳动率成反比,用此标准样品电泳并测定其涌动率,然后进行DNA分子长度(bp)的负对数——泳动距离作标准曲线图,可以用于测定未知分子的长度大小。

DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大,比如质粒分子,泳动率的大小顺序为:cDNA>IDNA>ocDNA。

2、电场强度

电场强度越大,带电离子的泳动越快,但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压,对于大片段分子的话,则需要更小的电压。

3、缓冲液离子强度

缓冲液pH常偏碱性或中性,此时核酸分子带负电,向正极移动。电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低时,pH会偏大,缓冲能力减弱,会影响电泳效果。


相信很多实验人员平时跑电泳的时候会遇到很多问题,配胶步骤繁琐、染料有毒、分辨率低、电压选择不当等都会极大的降低我们的工作效率。随着科技的发展,其实我们还有其它选择,那就是毛细管电泳仪,近期中国台湾Bioptic公司推出了一款便携式毛细管电泳仪——Qsep1 lite,这款仪器轻巧、简便、易操作;采用预制胶卡夹、即插即用、安全无毒;检测快速,最快可达到1分钟内/样本;灵敏度可达到pg级别,样品消耗只需1微升。可用于PCR产物分析、物种遗传多样性检测、核酸质检、质粒DNA酶切构造及纯度分析、文库质控、RNA质控等多种实验。


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Qsep1 lite


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毛细管电泳原理示意图


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PCR产物分析对比图


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RNA质控


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酶切产物