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随着测序价格不断降低,NGS的应用现在可以说是如日中天,市场中主流NGS系统,如Hiseq,Solexa,454等,越来越多的进入到大家的视野中。为了得到良好准确的测序结果,NGS前要求了解测序文库样品的尺寸分布和浓度,以提高测序的准备性,减少测序过程中不必要的尝试,降低测序成本。
传统的方法是使用琼脂糖凝胶电泳获得文库的尺寸分布,文库的浓度信息则是通过实时荧光PCR或分光光度计获得。这样的操作需要一系列的步骤、繁琐费时、效率低下、成本居高不下。数字PCR能够对二代测序的文库进行绝对定量检测,但成本高昂。
Real-time PCR能够对扩增文库中的分子进行高度精确的定量检测。Real-time PCR的灵敏性非常高,可以对浓度非常低的文库分子进行定量检测,即使其浓度低于传统方法可以检测的阈值。因此,这种方法能尽量减少对文库的扩增,降低可能的偏倚。
数字PCR能够对二代测序的文库进行绝对定量检测,而不需要标准品。能够实现核酸的绝对定量和稀有等位基因的检测。这种方法是在PCR扩增之前对样品进行微滴化处理,将DNA或cDNA样品分成上万个微滴,其中每个微滴或不含DNA靶分子,或含有一个或数个靶分子。每个微滴作为一个单独的PCR反应,利用终点法PCR对DNA进行扩增。在扩增后,分析每个微滴中荧光信号的存在(阳性)或不存在(阴性)。根据泊松分布原理及阳性微滴的比例可确定样品中靶分子的绝对数量。但是,这种技术需要特殊的仪器,并且花费较高,因此尚未广泛用于文库定量检测。
最近基于微流技术的电泳或者毛细管电泳越来越广泛的用于检测片段的大小和浓度。即买即用的芯片和预制胶卡夹省去了配置凝胶的步骤,使用方便。它们具有更高的通量,并且省去了很多的手动操作时间。除此之外,它们的灵敏度更高(对于检测的限制更少),并且能完全自动化的获取数据和输出电子化的数据资料。这些仪器能同时检测片段的大小和浓度。
这里着重介绍一款以毛细管电泳为原理的生物分析仪——全自动核酸蛋白分析系统QSEP100。
原理:采用毛细管电泳对样品进行分离分析,目前一代测序运用本技术完成(Sanger测序)。
Qsep100在建库前的genomic DNA、RNA质控,以及文库质控均有广泛的应用。
操作步骤:操作简单,五步轻松操作
结果显示:以峰图和模拟凝胶电泳图呈现,分析结果支持导出PDF、EXCEL、Word、JPG、PNG等格式。