PCR 扩增必看：让你的「引物设计」少走弯路
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作者:201321492800086
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发布时间: 2491天前
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聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称 PCR）是一种体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法。由美国科学家 PE Cetus 公司遗传部的 Dr. Mullis 发明并获得了 1993 年化学诺贝尔奖。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称 PCR）是一种体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法。由美国科学家 PE Cetus 公司遗传部的 Dr. Mullis 发明并获得了 1993 年化学诺贝尔奖。
PCR 技术目前是分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一，而引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环。使用不适合的 PCR 引物容易导致实验失败，比如表现为特异性差，扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），无条带或条带弱，等等。
PCR 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板 DNA 序列。因此，引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与成功与否。
现在 PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到某指定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行 PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。
引物的设计可以参考一下 10 条设计原则：
1、引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70% 或有连续 8 个互补碱基同源；
2、某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA 二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板；
3、寡核苷酸引物长度为 15～30bp，一般为 20～27bp，引物的有效长度>38 时，最适延伸温度会超过 Taq DNA 聚合酶的最适温度（74℃)，不能保证产物的特异性；
4、G+C 含量一般为 40%～60%。其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50% 寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于 Tm 值 5～10℃；
5、引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3′端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发；
6、引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合；
7、两引物之间不应不互补性，尤应避免 3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性；
8、引物的延伸是从 3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR）反应中，引物 3′端不能发生错配；
9、引物的 5′端限定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性；
10、密码子的简并：如扩增编码区域，引物 3′端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
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