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测序技术经过第一代、第二代的发展,读长从一代测序的近1000bp,降到了二代测序的几百bp,通量和速度大幅提升,而第三代测序的发展思路在于保持二代测序的速度和通量优势的同时,弥补其读长较短的劣势。三代测序与前两代相比,最大的特点就是单分子测序,测序过程无需进行PCR扩增。
那么三代测序当中会有哪些质控点呢?下面我们以PacBio为例为大家作以简单叙述:
与二代测序一样,PacBio三代测序的第一步也是核酸提取,其次是建库,其最主要的区别是建库过程中不涉及PCR反应。DNA分子打断之后,经过修复、接头连接、纯化和聚合酶绑定,即可出库准备上机测序。
以下图例为Qsep全自动毛细管电泳仪检测的实验结果图。对基因组DNA(图2)来说,它可以直观的看到片段大小及降解程度,并提供DQN值(1-10分)对基因组DNA进行完整性评估;对Total RNA(图3)来说,除了直观呈现18s和28s峰型分布和占比之外,同样也会有标准化评估的RQN值(1-10分),分值越高代表完整性越好。
例2:在全长转录组测序文库构建中,也可以用Qsep全自动毛细管电泳仪来进行质控,它的文库制备要相对较为复杂那么一点。首先,我们需要从总RNA中筛选获得polyA(+)RNA,之后利用SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit进行反转录合成cDNA。cDNA合成后需要使用KAPA HiFi PCR Kit进行PCR扩增,扩增后按片段大小对cDNA进行分选,为保证获得足够量的cDNA进行后续建库测序,分选后cDNA片段经过PCR再次扩增,之后经过末端修复、接头连接、片段筛选、杂交测序引物和DNA聚合酶绑定就可以上机测序了(图7)。
在上游实验环节,最关键的影响因素是文库的构建。高质量的文库产出的数据长度长,质量好;而低质量的文库产出的数据长度短,质量差。其次,就是看比例,需要关注有两个比例:一个是subreads与polymerase reads数据量的比例,比例过低反映测序过程中的低质量的序列较多;一个是zmw孔载入比例,根据孔中载入的DNA片段数分为P0、P1和P2,P1合理比例在40%-60%之间,上样浓度异常会导致P0或P2比例过高,有效数据量减少。不管是二代还是三代测序,想要下机数据好,前期的步步质控是关键。