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做测序的你,不知道这个技术就可惜了
来源: | 作者:201321492800086 | 发布时间: 58天前 | 200 次浏览 | 分享到:
随着第二代测序(Next Generation Sequencing,NGS) 技术和第三代测序( Third Generation Sequencing,TGS)技术的快速发展,生物研究领域发生了巨大变革。然而,传统的二代测序是从大量细胞中获取足够多的DNA或RNA,因此测序结果是这些细胞整体的表征,而不是单个细胞的具体情况。以我们熟悉的转录组测序为例,转录组测序是提取组织、器官或一群细胞的混合RNA进行测序,得到的是一群细胞的转录组的平均数据,或者说是有代表性的数据,而细胞群体中单个细胞的特异性信息往往被掩盖,很多低丰度的信息会在整体表征中丢失。再例如肿瘤中心的细胞,肿块边缘的细胞和肿块周围的细胞,乃至远端转移的细胞,其转录组等遗传信息是存在一定差异的,而传统的研究手段通常将整个肿瘤组织进行研究,或者将肿瘤组织简单分区分割,得到每一部分细胞基因表达的平均值,丢失了每个细胞的异质性信息,使得对肿瘤微环境中各种细胞转录组表达及免疫功能的理解始终停留在组织层面。为了弥补传统高通量测序的局限性,单细胞测序技术应运而生。
随着第二代测序(Next Generation Sequencing,NGS) 技术和第三代测序( Third Generation Sequencing,TGS)技术的快速发展,生物研究领域发生了巨大变革。然而,传统的二代测序是从大量细胞中获取足够多的DNA或RNA,因此测序结果是这些细胞整体的表征,而不是单个细胞的具体情况。以我们熟悉的转录组测序为例,转录组测序是提取组织、器官或一群细胞的混合RNA进行测序,得到的是一群细胞的转录组的平均数据,或者说是有代表性的数据,而细胞群体中单个细胞的特异性信息往往被掩盖,很多低丰度的信息会在整体表征中丢失。再例如肿瘤中心的细胞,肿块边缘的细胞和肿块周围的细胞,乃至远端转移的细胞,其转录组等遗传信息是存在一定差异的,而传统的研究手段通常将整个肿瘤组织进行研究,或者将肿瘤组织简单分区分割,得到每一部分细胞基因表达的平均值,丢失了每个细胞的异质性信息,使得对肿瘤微环境中各种细胞转录组表达及免疫功能的理解始终停留在组织层面。为了弥补传统高通量测序的局限性,单细胞测序技术应运而生。

图1. 2017年Nature和Science单细胞专刊


单细胞测序技术是指在单个细胞水平上,对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态,反映细胞间的异质性,拥有高通量地对单细胞进行转录组测序分析的特点,应用方向也相当广泛。在科研领域单细胞测序可以对人体各种细胞进行测序,获得人体单细胞转录组测序图谱,并基于基因表达将细胞分类,定义新的细胞,绘制所有细胞及其分子的空间组织方式,而目前多项人类细胞图谱工程也已经在轰轰烈烈的进行中;单细胞测序可以通过剖析细胞异质性,鉴定不同细胞表型,进一步结合拟时间曲线等手段探索细胞发育和分化路径,在解析干细胞发育和分化机理等过程中发挥重要作用。


在临床方面,单细胞测序可以应用于体外受精的胚胎测序:在把胚胎植回母体之前,先取一个细胞进行测序,确认基因正常后再植回,以保证胚胎是正常的;CTC细胞测序:癌症的血液检测,通过对血液中的肿瘤细胞进行测序,找到突变位点,针对性能进行靶向药物治疗;免疫细胞测序:免疫细胞在对抗原发生识别后,免疫细胞的基因组发生重排,并产生对抗原特异的抗体,对免疫细胞的测序,可以找出特异的基因结构。可以说,几乎所有涉及细胞的领域都可以应用单细胞测序,单细胞测序已经成为神经系统、发育、免疫研究、肿瘤等研究领域的强大的研究助攻!


单细胞测序能够获取每个单个细胞的遗传信息,检出混杂样品中的异质性细胞。目前主要有两种策略来实现单细胞测序:1.将单个细胞分离出来,并独立构建测序文库,最终进行测序的路线,具体方法有有限稀释法,流式分选法,激光切割法,显微操作法,微流分离法等。这种策略的优点是精确,节省细胞,缺点是单个细胞的操作成本比较高,随着测序细胞数增加,所需要的费用将直线上升。2.基于标签(barcode)的单细胞识别,给每个细胞加上独一无二的DNA序列,这样在测序的时候就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略,可以通过一次建库,测得数百上千个单细胞的信息。其优点是细胞通量高,单个细胞成本低,缺点是会浪费一些细胞。


目前,单细胞测序技术的流程主要包括单细胞悬液制备、单细胞分离、文库制备、测序与数据分析。


而影响单细胞测序数据的产出和质量的因素有很多,比如单细胞的分离效率、提取的DNA或RNA的质量、扩增的全基因组或转录组的质量、文库的质量等,因此测序流程中各个步骤的质控环节必不可少。全自动的核酸片段分析仪是测序过程中质控的主流方法,由杭州厚泽生物科技有限公司代理的Qsep系列全自动核酸片段分析仪,利用毛细管电泳的技术原理,在500bp以内分辨率可达1%,而且灵敏度下限可以达到1pg/ul,1-100个任意数量的灵活通量,5分钟即可上手,便捷操作,可以提供gDNA(RNA)-cDNA-文库的一体化质控方案,为单细胞测序保驾护航!



图2. Qsep系列全自动核酸片段分析仪

其中,gDNA或RNA的质量对后续文库构建至关重要,包括完整性、纯度及浓度,Qsep系列全自动核酸片段分析仪可以提供gDNA和RNA的质量指数评估(即DQN值和RQN值,值越高表示质量越好),同时也有28s/18s比值及DV200,用于辅助判断RNA质量。

图3. gDNA和RNA质控(Qsep结果图)

之后,通过体外转录或PCR扩增cDNA,将扩增好的cDNA用于文库制备和高通量测序,Qsep系列全自动核酸片段分析仪可对cDNA进行检测,利用smear分析功能判断样本的片段分布,一些低浓度的弥散cDNA样本也可以很好地检测;制备好的文库需要检测片段大小及接头残留情况,一般情况下质量较好的文库是长度范围150-700bp,接近正态分布的圆滑峰型,Qsep系列全自动核酸片段分析仪可以提供片段大小、片段分布范围、相对定量浓度等信息,用于判断建库是否成功。正如杭州厚泽生物科技有限公司CEO郑玲燕女士在单细胞技术及应用圆桌论坛上提出:“单细胞测序行业质检要求高,Qsep系列全自动核酸片段分析仪是一款核酸质检的专业仪器,可以帮助研究人员降低研究成本,高效、高质量完成质检工作”。

图4. cDNA和文库质控(Qsep结果图)


综上所述,单细胞测序可以高通量地检测细胞的转录组等遗传信息,在细胞异质性研究、细胞分群、新类型细胞发现、细胞发育分化等研究中发挥强大作用,推进生物学及医学研究飞速发展。