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临床基因检测第一关,严把提取样品质量关
来源: | 作者:201321492800086 | 发布时间: 174天前 | 628 次浏览 | 分享到:
二代、三代测序(NGS)的文库制备过程,对测序结果的影响很关键,而文库质量的好坏除建库方法和过程细节外,最重要的是初始样本质量。如何准确评估分离的核酸样品的质量确定样品是否具有足够高的质量?见下文案例。
【导语】二代、三代测序(NGS)的文库制备过程,对测序结果的影响很关键,而文库质量的好坏除建库方法和过程细节外,最重要的是初始样本质量。如何准确评估分离的核酸样品的质量确定样品是否具有足够高的质量?见下文案例。

■ 核酸质量评分:DNA


通过计算基因组质量评分(DQN),可以高效地评估gDNA的质量。由Qsep开发用于片段分析仪,数据分析软件评估每个样品与用户定义的特定应用阈值用于“高质量的DNA”,并指定0到10之间的DQN值。数值反映高于定义的阈值的DNA的百分比。


图1:不同DQN评分的基因组样本



■ 核酸质量评分:RNA


有两个指标可用于评估RNA的质量,软件计算RNA质量数(RQN),相当于RNA完整性数(RIN),RIN是广泛接受的总RNA完整性和质量指标。与RIN值类似,RQN值范围为1到10, 是基于专有的计算算法,考虑RNA电泳图谱的整个分布。


图2:不同RQN评分的RNA样品


尽管RIN / RQN值是从新鲜组织分离的RNA的质量的可靠评价标准,但它们并不是降解福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样品的RNA质量的十分有效的评价标准。为了解决这个问题,Illumina的科学家开发了DV200这个检测标准,它可以计算RNA片段大于200nt大小的百分比。考虑到DV200值和二代文库产量之间的更强的相关性,与RQN值相比,DV200的评价对于评估FFPE RNA质量是更为理想的。



图3:不同DV200评分的FFPE RNA 样品



■ 基因组DNA和FFPE DNA


使用DNA卡夹检测所测样品后,Qsep软件可以自动准确地测定gDNA样本的大小和DQN。


DNA在福尔马林固定过程中经历了大量的化学修饰,包括与蛋白质交联和降解成较小的片段。从FFPE样品中分离出的DNA质量因固定方法和标本组织年龄的不同而有很大差异。使软件中Smear功能可以对降解的FFPE DNA进行质量评估(如下图,以1k为阈值)。它们提供DQN值进行简化的质量评估,用于指导以下内容:


  1. 第一次扩增中使用的PCR循环次数

  2. 打断所用的条件

  3. 文库构建的质量


图4:FFPE样本检测DQN情况对比



其后对这四个样品进行分批次建库,多批次结果均一致,对文库用Qsep进行片段检测,结果如下图。

图5:对应样本的文库质控结果



如图所示,质量评分最低的最后一个样本,所构建文库大小显著偏小,引物二聚体残留较多,此外文库浓度也是4个文库中最低,且多批次一致。因此文库质量的好坏除建库方法和过程细节外,最重要的还是初始的样本质量。文库质量的高低也影响了后续测序的结果以及数据的结果,因此做好提取样品的质控是第一步,也是最关键的一步。



■ 建库前样品


在文库构建前对样品进行片段打断时可以对打断的样品进行一次质控,用于检测打断的条带是否满足预期需求,以确定是否需要改变打断的条件。

图6:打断样品的检测图



可通过软件Smear功能来确定片段的主要分布区间,以期得到最佳打断打断效果。

肿瘤液态活检中游离核酸提取质量的质控也是目前相对比较热门的方向,不少用户使用Qsep系列来检测cfDNA样品,Qsep系列可以达到pg级的检测灵敏度,对于cfDNA样品的检测相对轻松,可以准确测定样品的目的区域和大片段核酸的分布比例。

图7:cfDNA样品的检测图



单细胞测序中RNA反转录后的产物cDNA样品的检测,通过检测cDNA的片段分布来定是否能进行文库构建。

图8:cDNA样品的检测图



■ 文库


不同的二代测序文库根据测序仪的读长需求会有不同的大小分布,软件可以根据调点的分布准确的测定条带的分布区间,使用Smear分布功能,可以准确计算文库的平均片段以及主要片段集中区域。

图8:文库的片段分布检测图



Qsep系列全自动毛细管电泳仪采用可抛弃式的预制胶卡夹,即插即用,全自动进样,无须人工制胶、灌胶、上样,免去了手工制胶的繁琐,能让一般用户在短时间内学会操作系统,并自动分析样品得出结果。也可用于DNA、RNA和蛋白检测 ,通量灵活,可处理1-100个任意个数样本。且具有单通道和四通道型号仪器,可满足不同用户需求,单次使用样本量极少,且最低检测限为pg级。

图9:不同通量的Qsep系列全自动毛细管电泳仪


在高通量测序中进行全程的样品质控中,Qsep系列全自动毛细管电泳仪为稳定高质量的数据产出提供了保证,让文库的构建的每一步都可以清晰的进行回溯。

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